1. Introduzione
   Scopo del fascicolo: destinatari
   Struttura del fascicolo: Introduzione in due parti e supplementi
2. Descrizione di alcuni termini
   Definizioni di sinonimi
   essicazione – disidratazione
   • prodotto – campione – materiale – solidi
   • acqua – umidità – solvente
   • freeze drying – liofilizzazione
   Definizione di soluzione
   • soluzione-solidi/soluto-solvente
   Nota sul glossario
3. Cos’è l’essicazione?
4. Perché essiccare un campione?
5. In che modo possiamo essiccare il nostro prodotto?
6. Cos’è la liofilizzazione e perché scegliere questo processo?
   Un’analisi iniziale
7. Com’è una tipica liofilizzazione?
8. Uno sguardo più approfondito alle proprietà dei materiali
9. Introduzione al trasferimento di calore e di materia
10. Uno sguardo più approfondito al processo di liofilizzazione
    Congelamento, velocità di congelamento e sublimazione del trasporto di materia, interfaccia e mantenimento del desorbimento della struttura, gradienti di umidità, end-point
11. Domande da porsi nella scelta o nell’uso di un liofilizzatore
    Proprietà del materiale
    • requisiti di congelamento: concentrazione., compensazione, temperatura
    • comportamento di stabilità: temperatura, limiti, contenuto di umidità finale
    Capacità necessarie
    • volume del lotto, caricamento nella camera
    • velocità di produzione
    Parametri di liofilizzazione
    • temperature di riscaldamento
    • tipi di camera, superficie campione, aree nei contenitori
12. Supplementi
    A) Proprietà dell’acqua
    B) Proprietà del materiale
    C) Trasferimento di materia
    D) Trasferimento di calore

Introduzione

Il presente articolo ha lo scopo di presentare il processo di liofilizzazione a coloro che utilizzeranno questo procedimento in futuro o che attualmente stanno usando un liofilizzatore e desiderano sapere di più sul suo funzionamento.

Per venire incontro a lettori con esigenze diverse, il fascicolo è stato diviso in due parti.

La prima parte, che comprende il testo principale, fornisce una breve e concisa analisi dei vari aspetti della liofilizzazione relativamente al processo e ai materiali da liofilizzare.

Nella seconda parte si trovano supplementi agli argomenti trattati nel testo principale, nei quali sono contenute spiegazioni complete dei fenomeni coinvolti nel processo di liofilizzazione.

Consigliamo una prima lettura completa del testo principale, al fine di ottenere una visione generale, per poi dedicarsi successivamente all’esame dei supplementi di interesse.

Descrizione di alcuni termini

Prima di iniziare il testo principale, è bene definire alcuni termini.
I termini essiccazione e disidratazione sono utilizzati in maniera intercambiabile per descrivere il processo della completa eliminazione dell’acqua da un materiale.
I termini prodotto, campione e materiale sono usati in maniera intercambiabile per descrivere le “cose” che verranno liofilizzate o le “cose” che si ottengono successivamente al processo di liofilizzazione.
I termini acqua e umidità sono utilizzati in maniera intercambiabile per descrivere ciò che deve essere eliminato dal campione tramite liofilizzazione.
I termini freeze drying e liofilizzazione possono essere usati in maniera intercambiabile per descrivere, appunto, la liofilizzazione stessa.
Infine, è bene definire tre termini che fanno riferimento al nostro campione, ossia: solidi o soluto e solvente.
Solvente è il materiale liquido in cui si trovano i solidi o i soluti. In questo fascicolo, l’acqua è il solvente.
I solidi possono essere suddivisi in due gruppi: quelli solubili (presenti nel solvente come singole molecole) e quelli insolubili (presenti nel solvente come gruppi di molecole). I solidi solubili e i solventi costituiscono una soluzione, mentre i solidi insolubili e i solventi costituiscono una sospensione. Un campione può contenere nel solvente sia solidi solubili sia insolubili.

Cos’è l’essiccazione?

L’essiccazione o disidratazione è un processo in cui il solvente presente nel campione – nel nostro caso l’acqua – viene fisicamente estratto in modo da ottenere solidi in condizioni essenzialmente secche (es. privi d’acqua).

Perché essiccare un campione?

Sono molte le ragioni per cui si desidera essiccare un materiale, come elencato qui di seguito. È necessario ricordare che l’obiettivo principale di un processo di liofilizzazione è ottenere un materiale essiccato che rispecchi uno o più obiettivi di quelli elencati nella Tabella 1, essendo quindi il prodotto finale l’aspetto più importante della liofilizzazione.

Tabella 1: Obiettivi di liofilizzazione legati al prodotto

• Preparazione dei campioni di tessuto adatti per l’analisi istologica che impiegano tecniche di microscopio, inclusa la microscopia elettronica. • Preparazione del campione come fase primaria delle procedure di analisi chimiche/biochimiche. • Stabilità di conservazione dei materiali a lungo termine, come ad esempio cibi, cellule microbiche, enzimi per kit di analisi, sangue, ecc. • Recupero di prodotti da una miscela di reazione in una forma (essiccata) facilmente maneggiabile.

Per analizzare questi obiettivi della liofilizzazione possiamo impiegare, come esempi, alcuni dei materiali elencati nella Tabella 2 per i quali la liofilizzazione risulta auspicabile.

Dall’ampia varietà di prodotti in questo elenco si evidenzia che le differenze degli obiettivi specifici da raggiungere con la liofilizzazione di un prodotto e quelle delle sue proprietà danno luogo ad esigenze estremamente varie nel processo di liofilizzazione.

La liofilizzazione viene impiegata per ottenere una stabilità di conservazione a lungo termine dei prodotti alimentari e altri materiali biologici (colture microbiche, enzimi, vaccini, costituenti del sangue e medicinali).

In questo caso, l’obiettivo si concentra sull’arresto di reazioni biologiche e chimiche responsabili della degradazione nel materiale umido per mezzo della riduzione dell’attività dell’acqua nel prodotto.

In alcuni casi, specialmente per i materiali biologici sopra citati, è necessario inoltre che l’attività biologica inerente venga preservata seguendo il processo di essiccazione e, successivamente, che sia recuperabile al momento della reidratazione.

Il mantenimento dell’attività biologica è pertanto un requisito supplementare oltre alla stabilità di conservazione a lungo termine.
Un obiettivo alquanto diverso della liofilizzazione è la preparazione di campioni di tessuto per la microscopia elettronica.

Tabella 2: Alcuni materiali tipici essiccati mediante liofilizzazione

• Microorganismi (batteri, lieviti), comprese le colture starter nella carne e nei latticini) • Virus • Vaccini e frazioni ematiche antitossine • Enzimi (per sistemi analitici e/o reazioni in generale) • Tessuti e materiali ossei per trapianti • Reagenti e standard biologici • Materie alimentari (bevande, frutta, verdura, carne, pesce) • Animali interi per esposizione in musei • Oggetti archeologici (legno, pelle, carta) • Preparati farmaceutici • Vitamine • La maggior parte degli agenti sensibili nei laboratori chimici / biochimici (compresi i radicali liberi e i mezzi fisiologici) • Tessuti e cellule per microscopia elettronica

In questo caso è essenziale che la struttura del tessuto resti invariata nel processo di essiccazione.

La liofilizzazione può essere anche utilizzata in alcuni tipi analisi chimiche quando si desidera ottenere un campione sotto forma di polvere secca, o per rispettare requisiti del sistema di analisi “senza acqua”, o per concentrare il prodotto prima dell’esame, aumentando in questo modo la sensibilità dell’analisi.

In questo caso, è essenziale che nel processo di liofilizzazione il campione non cambi la composizione chimica a causa dell’instabilità dei componenti del campione. Questo obiettivo può imporre requisiti severi sulle condizioni di essiccazione impiegate.

Un’altra applicazione simile della liofilizzazione è il recupero di intermedi di reazione da sistemi di reazione con diluizione, specialmente laddove ulteriori fasi di reazioni vengono eseguite al meglio a concentrazioni più elevate. In questo caso, la preservazione dell’attività chimica e/o biologica è un requisito essenziale per l’accettazione del processo di essiccazione.

Dagli esempi sopra menzionati, è possibile notare che le varie destinazioni d’uso finali del prodotto impongono diversi requisiti al processo come ad esempio il mantenimento dell’attività biologica, della struttura fisica, la prevenzione di mutamenti chimici nella conservazione, ecc.

Pertanto, nella successiva osservazione di questo processo, è importante tenere a mente che è il prodotto a determinare quale dei metodi di liofilizzazione possibili può essere impiegato e quali sono le condizioni di processo possibili.

Più avanti vedremo in che modo agiscono le proprietà del prodotto ed i requisiti legati al suo uso sopra menzionati nel determinare le condizioni che possono essere impiegate nella preparazione del prodotto liofilizzato.

In che modo possiamo essiccare il nostro prodotto?

Vi sono diversi metodi di essiccazione che possono essere impiegati per preparare materiali essiccati. Alcuni sono più adatti per la produzione industriale su vasta scala, altri per usi in laboratorio, mentre altri ancora sono adatti in teoria per entrambi gli usi. Qui di seguito sono elencati vari metodi ed il loro relativo settore principale di impiego.

Abbiamo già menzionato la liofilizzazione come metodo per la preparazione di materiali essiccati. Alcuni dei metodi di essiccazione elencati sono più adatti per i liquidi (per esempio: essiccazione spray, a tamburo o essiccazione con sistema roller) mentre altri sono più adatti per solidi (essiccazione pneumatica, a letto fluido, a tunnel o a camera).
La liofilizzazione è piuttosto particolare essendo adatta sia per i solidi, sia per i liquidi. E questo grazie ai principi fisici su cui si basa. Questo argomento, le basi fisiche della liofilizzazione, costituirà una parte importante del resto del testo principale.

Questi attributi particolari sono importanti per spiegare la vasta gamma di applicazioni della liofilizzazione nell’ambiente di laboratorio; tuttavia, è anche indispensabile notare che l’ampio consenso riscontrato dal processo di liofilizzazione è dovuto essenzialmente alla facilità con cui la liofilizzazione può essere condotta in laboratorio, anche da personale senza una particolare conoscenza del processo.

Tabella 3: Esempi di processi di essiccazione

• Liofilizzazione (I, L) • Essiccazione in camera (I, L) • Essiccazione a tunnel (I) • Essiccazione spray (I, L) • Essiccazione istantanea (I) • Essiccazione a letto fluido (I)

• Essiccazione a tamburo (I) • Essiccazione su nastro (I) • Essiccazione a punto critico (L) • Essiccazione a vuoto (I, L) • Essiccazione a microonde (I) • Essiccazione a macro-onde (I)

(I) = industria, (L) = laboratorio, (I,L) = sia laboratorio che industria

Mentre è possibile liofilizzare dei campioni senza sapere molto sulla liofilizzazione, lo scopo del presente fascicolo è quello di fornire vari livelli di preparazione; dall’operatore del processo di liofilizzazione al project manager, e di fornire una migliore comprensione di questo processo e soprattutto di comprendere la relazione delle condizioni di processo rispetto alle proprietà del prodotto, in modo da ottenere una più completa comprensione di entrambe queste opportunità nonché dei limiti associati alla liofilizzazione.

Cos’è la liofilizzazione e perché scegliere questo processo?

Un’analisi iniziale

La liofilizzazione è un processo a tre fasi.
Nella prima fase, il prodotto viene congelato allo stato solido in modo tale che l’acqua presente nella materia si trasformi in ghiaccio. (In realtà, una piccola porzione dell’acqua è fortemente legata dai solidi e non si congela – maggiori informazioni al riguardo sono disponibili nei supplementi).

Nella seconda fase del processo di liofilizzazione il ghiaccio formato nella fase di congelamento viene rimosso tramite la trasformazione diretta da solido a vapore per mezzo di un processo chiamato sublimazione.

Nella terza fase del processo, l’acqua che era fortemente legata ai solidi del campione (chiamata acqua adsorbita) viene trasformata in vapore ed estratta dal prodotto. Questo processo viene definito desorbimento.

Differenze principali tra la liofilizzazione e gli altri processi di essiccazione:
1) il materiale viene solidificato prima dell’essiccazione
2) la rimozione della maggior parte dell’acqua dal campione avviene tramite una conversione diretta dell’acqua dalla stato solido a quello gassoso.

In tutti gli altri processi di essiccazione l’acqua è presente nella materia allo stato liquido, e la rimozione dell’acqua avviene tramite evaporazione (es. l’acqua si trasforma dallo stato liquido in vapore).

La mobilità dell’acqua allo stato liquido nella maggior parte dei processi di essiccazione rispetto all’immobilità dell’acqua allo stato solido (ghiaccio) durante la liofilizzazione ha importanti conseguenze sulle proprietà del prodotto essiccato ottenuto.

Inoltre, anche le differenze piuttosto notevoli dei livelli di temperatura a cui l’acqua si trasforma in vapore sono importanti.

Il processo di sublimazione (nella liofilizzazione) avviene a basse temperature (generalmente a circa -20°C fino a -30°C), laddove per l’evaporazione dell’acqua liquida la temperatura per il passaggio dalla stato liquido a quello gassoso è più alta e compresa tra +50°C e +100°C.

In situazioni in cui l’integrità dei componenti della materia essiccata è importante, come per la preparazione di sezioni di tessuto essiccato per analisi microscopiche, la liofilizzazione rappresenta una scelta logica.

In casi in cui la stabilità chimica o la preservazione dell’attività biologica è importante, la scelta di condizioni di basse temperature per la rimozione della maggiore quantità di acqua dal prodotto impone di optare per la liofilizzazione.

Il motivo per cui la liofilizzazione non è ritenuta ottimale per tutte le situazioni di essiccazione è da ricondursi principalmente a considerazioni economiche (sia in termini di investimento sia di costi di gestione), essendo i costi della liofilizzazione generalmente maggiori rispetto a quelli di altri processi di essiccazione.

Quindi, per i casi in cui fattori specifici prodotto-qualità risultano di minore importanza è possibile che il costo maggiore della liofilizzazione non sia giustificato. (Per situazioni di laboratorio, considerazioni di costi di gestione non sono generalmente significative).

Come abbiamo visto in precedenza, (Tabella 1), vi sono molte aree in cui requisiti particolari legati al prodotto richiedono l’uso della liofilizzazione se si desidera ottenere un prodotto dalla qualità soddisfacente.

Nei capitoli seguenti verrà esaminato il processo di liofilizzazione più in dettaglio e messo in relazione con le proprietà dei materiali da liofilizzare.

Ma prima di tutto esamineremo la struttura fisica di un liofilizzatore tipico, che probabilmente il lettore già possiederà nel proprio laboratorio.

Cos’è un liofilizzatore tipico?

Nel descrivere un liofilizzatore tipico si deve osservare per prima cosa che, sebbene tutti i liofilizzatori siano costituiti dagli stessi componenti di base, essi possono variare notevolmente in termini di dimensione ed aspetto.

Anche se si dovesse tentare di individuare le differenze tra i liofilizzatori da laboratorio e quelli industriali, verrebbe subito alla luce che un liofilizzatore impiegato per la produzione alimentare con una capacità di tonnellate al giorno, ad esempio per la produzione di caffè liofilizzato, opera sostanzialmente seguendo lo stesso principio di un liofilizzatore da laboratorio per la preparazione di pochi grammi al giorno di campioni di tessuto destinati all’analisi al microscopio.

Essendo questo fascicolo destinato principalmente a persone che utilizzano liofilizzatori da laboratorio, gli esempi qui presi in esame si baseranno su un sistema da laboratorio. La figura 1 mostra una serie di liofilizzatori da laboratorio di diverse dimensioni e aspetti.

Per questa analisi, ci concentreremo su un singolo modello, il piccolo liofilizzatore in primo piano, poiché mostra chiaramente tutti gli elementi di
base di un liofilizzatore tipico.

Sulla sinistra si può osservare la pompa a vuoto (1), collegata mediante un tubo ed una valvola ad un sistema di condensatore refrigerato (2) che estrae l’acqua.
Sulla parte anteriore del liofilizzatore, vi sono una serie di dispositivi di controllo e di misurazione (3), ed infine una serie di di camere per campione (4), alcune delle quali sono collegate al condensatore per mezzo di tubi e sistemi di valvole (5).

Tutti I liofilizzatori mostrati sono costituiti dagli stessi componenti di base, sebbene nella maggior parte dei casi, la pompa a vuoto ed il condensatore refrigerato siano nascosti per motivi estetici nell’alloggiamento sotto la camera.

Possono essere impiegati molti tipi di sistemi di tubi e valvole (5) per collegare varie camere al condensatore refrigerato. Alcuni collegamenti sono piuttosto lunghi e possono presentare una geometria complessa.

1. Pompa da vuoto 2. Condensatore refrigerato 3. Dispositivi di controllo e di misurazione 4. Camere del campione

5. Sistemi di tubi e valvole 6. Sistemi di tubi e valvole 7. Controller per la registrazione della temperatura / vuoto

Il liofilizzatore tipico può essere visualizzato in un grafico semplice (fig. 2) dove i numeri indicati corrispondono ai componenti sopra citati. Nel Supplemento C sono impiegati grafici simili per descrivere il trasferimento di materia legato alla liofilizzazione.